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蛋白純化方法選擇
來源: | 作者:muchen | 發(fā)布時間: 2021-08-05 | 700 次瀏覽 | 分享到:

蛋白純化的目的是將目標蛋白質從細胞裂解液的全部組分中分離出來,同時仍保留蛋白的生物學活性及化學完整性。蛋白質的分離和提純工作是一項艱巨而繁重的任務,需根據蛋白的特性選擇合適的純化方法來提高獲得的蛋白制品的純度。

蛋白純化方法
蛋白純化的原理為:不同蛋白質的氨基酸序列及空間結構不同,導致其在物理、化學、生物學等性質上存在差異,利用待分離蛋白質與其它蛋白質性質上的差異,即可以設計出一套合理的蛋白純化方案。

蛋白的純化大致分為粗分離階段和精細純化階段兩個階段。粗分離階段主要將目的蛋白和其他細胞成分如RNA、DNA等分開,常用的方法為硫酸銨沉淀法。精細純化階段的目的是把目的蛋白與其他大小及理化性質接近的蛋白區(qū)分開來,常用的方法有:凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水層析、親和層析等。

凝膠過濾層析
凝膠過濾(也叫排阻層析或分子篩)是一種根據分子大小從混合物中分離蛋白質的方法。不同蛋白的形狀及分子大小存在差異,在混合物通過含有填充顆粒的凝膠過濾層析柱時,由于各種蛋白的分子大小不同,擴散進入特定大小孔徑顆粒內的能力也各異,大的蛋白分子會被先洗脫出來,分子越小,越晚洗脫,從而達到分離蛋白的目的。一般來說,凝膠過濾層析柱越細、越長純化的效果越好。凝膠過濾層析詳細介紹

凝膠過濾層析所能純化的蛋白分子量范圍很寬,純化過程中也不需要能引起蛋白變性的有機溶劑。缺點是所用樹脂有輕度的親水性,電荷密度較高的蛋白容易吸附在上面,不適宜純化電荷密度較高的蛋白。


離子交換層析
離子交換層析是一種依據蛋白表面所帶電荷量不同進行蛋白分離純化的技術。蛋白表面通常會帶有一定的電荷,電荷的氨基酸殘基均勻地分布在蛋白質的表面,在一定條件下可以與陽離子交換柱或陰離子交換柱結合。這種帶電分子與固定相之間的結合作用是可逆的,在改變pH或者用逐漸增加離子強度的緩沖液洗脫時,離子交換劑上結合的物質可與洗脫液中的離子發(fā)生交換而被洗脫到溶液中。由于不同物質的電荷不同,其與離子交換劑的結合能力也不同,所以被洗脫到溶液中的順序也不同,從而達到分離的效果。離子交換色譜的基本原理及實驗操作

親和層析
親和層析純化是利用生物大分子物質具有與某些相應的分子專一性可逆結合的特性進行蛋白純化的技術。該方法
適用于從成分復雜且雜質含量遠大于目標物的混合中提純目標物,具有分離效果好、分離條件溫和、結合效率高、分離速度快的優(yōu)點。親和層析技術可以利用配基與生物分子間的特異性吸附來分離蛋白,也可以在蛋白上加入標簽,利用標簽與配基之間的特異性結合來純化蛋白。


配基與生物分子之間的特異性吸附
配基:在親和層析中起可逆結合的特異性物質稱為配基。配基可以是酶的底物、抑制劑、輔因子、特異性的抗體等。
親和層析是根據固定相的配基與生物分子之間的親和能力不同來進行相互分離的。依據選擇性的高低親和層析可以分為基團性親和層析及高選擇性(專一性)親和層析。基團親和層析一種配基可以吸附多種蛋白,如以三嗪染料為配基純化含有糖基的一類蛋白質或糖蛋白,高選擇性親和層析一種配基只能吸附一種蛋白,如單克隆抗體對抗原的特異性的吸附。

標簽純化
利用基因工程技術在蛋白的氨基端或羧基端加入少許幾個額外氨基酸,這個加入的標記可用來作為一個有效的純化依據。蛋白純化標簽選擇

GST標簽純化:在蛋白質序列中加入谷胱甘肽S 轉移酶(GST),然后利用Glutathione Sepharose 4B 作親和純化,再利用凝血酶或因子Xa 切開。

His標簽純化:組氨酸標記(His-tag)是最通行的標記之一,在蛋白質的氨基端加上6~10 個組氨酸,在一般或變性條件(如8M 尿素)下借助它能與Ni2+螯合柱緊緊結合的能力,用咪唑洗脫,或將pH 降至5.9 使組氨酸充分質子化,不再與結合Ni2+使之得以純化。

疏水作用層析
疏水作用層析是利用鹽-水體系中樣品分子的疏水基團和層析介質的疏水配基之間疏水力的不同而進行分離的一種層析方法。該法利用了蛋白的疏水性,蛋白經變性處理或處于高鹽環(huán)境下疏水殘基會暴露于蛋白表面,不同蛋白疏水殘基與固定相的疏水性配體之間的作用強弱不同,依次用從高至低離子強度洗脫液可將疏水用作由弱至強的組分分離。


疏水作用層析實驗操作成本低且純化得到的蛋白具有生物學活性,是一種通用型的分離和純化蛋白質的方法。該實驗遵循“高鹽上樣,低鹽洗脫”的原則:高濃度鹽水溶液中蛋白質在柱上保留,在低鹽或水溶液中蛋白質從柱上被洗脫,特別適用于濃硫酸銨溶液沉淀分離后的母液以及該沉淀用鹽溶解后的含有目標產品的溶液直接進樣到柱上,當然也適用7mol/鹽酸胍或8mol/L 脲的大腸桿菌表達蛋白提取液直接進樣到柱上,在分離的同時也進行了復性。


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